基因治疗

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基因治疗(gene therapy)是利用分子生物学方法将目的基因导入患者体内,使之表达目的基因产物,从而使疾病得到治疗,为现代医学和分子生物学相结合而诞生的新技术。基因治疗作为疾病治疗的新手段,它已有一些成功的应用,并且科学突破将继续推动基因治疗向主流医疗发展。

科学家们采取了合乎逻辑的步骤,试图直接将基因植入人体细胞中,其中具体关注一些由单基因缺陷引起的疾病,如囊肿性纤维化,血友病,肌肉萎缩症和镰状细胞性贫血。不过,这非常困难,主要是因为携带DNA很大段且要将它们置于大基因组的正确的位置。今天,大多数的基因治疗研究的目的是癌症和遗传性疾病相关的基因缺陷或丢失。

科学家曾尝试用此方法去治疗一种叫严重免疫缺陷综合征(Severe Combined Immunodeficiency, SCID)的疾病,并得到一定的成果。基本原理是用已经被驯化了的病毒携带健康的基因,植入病人的细胞里,以此去修补本身有缺陷的基因。

应用肿瘤抑制基因或抑癌基因, 对癌症进行靶向治疗,是基因治疗领域里重要的研究项目。 目前应用较多的是p53肿瘤抑制基因。

类型

种系基因疗法

在种系基因治疗的情况下,生殖细胞,即精子或卵子,通常依据功能基因被修改整合进入基因组中。因此,这种通过治疗后的改变可以遗传且能传给后代。这种新的方法,从理论上说,应该会对基因性疾病和遗传性疾病的对抗非常有效。然而,许多司法管辖区禁止在人类身上应用这一治疗手段,因为种种技术与伦理问题。

体壁基因治疗(Somatic gene therapy)

在体细胞基因治疗的情况下,治疗基因转移到病人的体细胞。任何基因的修改和产生的效果将只体现在接受治疗的病人身上,并不会被病人的子女或后人继承,这主要与体细胞的性质与功能有关。

载体

病毒

所有的病毒结合到他们的宿主细胞,引入它们的基因物质作为其宿主细胞复制循环的一部分。这种遗传物质包含基本信息比如如何产生这些病毒的副本,破坏人体的正常生产机制,以满足该病毒的需要。宿主细胞将执行这些指令并产生更多的病毒副本,导致越来越多的细胞受到感染。某些类型的病毒将自己的基因插入到宿主的基因组,但自己并不进入细胞。其他伪装成蛋白质分子穿透细胞膜进入细胞。 两种类型的病毒转化:裂解和溶原。它的DNA插入后不久,该病毒的迅速裂解周期从细胞产生更多的病毒,爆发,感染更多的细胞。溶源性病毒整合自己的DNA到宿主细胞DNA中,并可能活在体内好几年以致一触即发。该病毒复制的细胞也并不会造成人身伤害,直到它被触发。触发释放宿主细胞的DNA,用它来产生新的病毒。艾滋病毒是一种溶源性感染。一些科学家认为,如果他们找到其触发来源,他们将能够阻止整个身体不断复制该病毒。

反转录病毒

反转录病毒的遗传本质是RNA分子,而其宿主细胞的遗传物质的形式是DNA。当反转录病毒感染宿主细胞,其RNA将与一些共同作用,即逆转录酶整合酶,进入细胞。这种反转录病毒的RNA分子必须产生对应的反转录DNA分子,才能进入宿主细胞的遗传物质相结合。这种由一个RNA分子反转录得到DNA的复制过程称为反转录。它是由病毒中携带的一种酶作用的,这种酶称为逆转录酶。在此之后产生的DNA必须纳入宿主细胞基因组中。也就是说,它必须插入细胞中染色体的大DNA分子中。这个过程是通过另一个病毒中称为整合酶的酶进行的。 现在,该病毒的遗传物质已被插入,可以说,宿主细胞已包含新的基因。如果这个宿主细胞分裂后,其后代都将包含新的基因。只是有时候不是很及时的表达。 有时基因使用治疗反转录病毒的问题是,整合酶可以插入宿主的遗传物质的病毒基因组的任意位置,它的随机塞到成染色体遗传物质。如果遗传物质恰好在对宿主细胞的一个正常基因的中间插入,这种基因将会被破坏,这被称为插入突变。如果基因恰好是一个调节细胞分裂的基因那么插入后细胞分裂失控(即癌症)可能发生。这个问题最近开始得到解决,利用锌指核酸包括染色体的序列,如β-珠蛋白基因座控制区的工地直接融合到特殊。基因治疗试验中使用的反转录病毒载体治疗X联重症联合免疫缺陷(X - SCID)代表了基因疗法迄今最成功的应用。二十多名患者已在法国和英国经治疗后观察发现其免疫系统重建率很高。

腺病毒

腺病毒是携带以双链DNA为遗传物质的病毒。他们引起人类呼吸道肠道,和眼睛感染(尤其是感冒)。当这些病毒感染宿主细胞,同时也将它们的DNA引入到宿主的DNA分子中。该腺病毒遗传物质只是暂住在宿主细胞中。其DNA分子在宿主细胞的核中自由存在,并在像任何其他基因一样的转录。唯一不同的是,这些基因在细胞分裂时是不会复制其后代细胞将不会有这种基因。这个载体系统已用于治疗癌症,并且第一个基因治疗产品即用于癌症的治疗。Gendicine,是一种腺病毒。它是p53基因的腺病毒为基础的基因疗法,在2003年被中国食品监督局FDA批准用于治疗头颈部癌症的产品。 关于腺病毒载体的担忧在1999年杰西基辛格死后被提出来予以重视。从那时起,利用腺病毒载体进行基因治疗的工作重点便被放在病毒的遗传学缺陷处。

腺相关病毒

腺相关病毒,来自于parvovirus病毒家族,是拥有单链DNA的基因组的小型病毒。野生型腺相关病毒的遗传物质可以有近100%的准确性插入在19号染色体上的特定位点。但是,重组腺相关病毒,其中不包含任何病毒基因只有治疗基因,不整合到基因组中。相反,重组病毒在其两端通过ITR(末端反向重复)重组基因融合,形成圆环式可表达的基因组。同时这种病毒的利用也有一些缺点,其中包括可携带DNA及其少量(低容量),并且生产它存在难度。生产问题最近由Amsterdam Molecular Therapeutics得到解决。这类型的病毒正在使用阶段,但是,因为它不具有致病性(大多数人携带这种无害的病毒)。与腺病毒不同的是,与大多数腺相关病毒治疗的人不会建立一种免疫应答来清除它。腺相关病毒的试验仍在进行中或准备中,主要是用于治疗肌肉和眼部疾病,病毒似乎对于这两种组织特别有用。然而,临床试验也已展开腺相关病毒载体用于基因传递到大脑的实验。这是很可能的,因为腺病毒能够感染非分裂(静态)细胞,如它们的基因组中神经元长时间表达。

病毒载体的蛋白质包被的假型化

上述的病毒载体具有天然宿主的细胞群,他们感染最有效。逆转录病毒的天然宿主细胞的范围有限,虽然腺病毒和腺相关病毒能够有效感染相对范围内的细胞,但某些细胞类型很难控制并驾驭这些病毒体。进入易感细胞是由病毒表面的蛋白包膜介导的。逆转录病毒和腺相关病毒有一个单一的蛋白质包被膜,而腺病毒有包膜蛋白和纤维共同交联于病毒表面。对这些病毒的包膜蛋白结合到每个细胞表面分子,如heparin sulfate,他们定位在潜在寄主的表面,像特定的蛋白质受体一样。进入潜在寄主需要宿主细胞表面蛋白与病毒表面蛋白很好的相互作用。根据基因治疗的目的,我们应该尽量控制细胞的易感性适中。为此,许多载体发展到 内源性病毒包膜蛋白已被其他病毒包膜蛋白或嵌合体蛋白所取代。这种嵌合体包含病毒蛋白必须的部分,可以协同进入寄主并且与宿主细胞蛋白相互作用。其中包膜蛋白病毒已被描述成pseudotyped viruses。例如,最流行的基因治疗试验中使用的逆转录病毒载体是lentivirusSimian免疫缺陷病毒包膜蛋白-G蛋白,来自Vesicular stomatitis virus。

顺式反式作用元件

复制缺陷型载体始终包含一个“传输结构”。它携带那些对基因功能执行相关的基因序列,包装序列,复制和在必要时启动反转录。这些均是顺式作用元件。反式作用元件是病毒性的元素,它可以在不同的DNA分子进行编码。例如,病毒结构蛋白可以从不同的基因组元件进行表达。

单纯疱疹病毒

单纯疱疹病毒是一种人类嗜神经病毒。这主要是研究基因在神经系统的传递。野生型HSV - 1的病毒能够感染细胞。受感染的神经元都没有能够对抗的免疫系统。虽然没有转录病毒潜伏明显,它具有神经元特异性启动子,可以继续正常工作。单纯疱疹病毒抗体- 1比较常见,但疱疹病毒感染的并发症很罕见。

非病毒方法

非病毒的方法比某些病毒方法更有优势,因为其大规模生产的简单工艺和低免疫原性。在此之前,转染和基因表达水平低的缺点是非病毒基因治疗十分困难。然而,在载体技术的最新进展下,这种手段与病毒式治疗异曲同工。

裸DNA

这就是非病毒转染的最简单方法。临床试验已成功进行了一些裸DNA质体的肌肉注射,但是相比其他的转染方法,其表达非常低。除了质体实验,naked PCR的试验也有开展并取得一定的成功。这一成功为更有效的方法提供可能,诸如电穿孔仪(electroporation), 声孔作用(sonoporation),还有基因枪的应用,其中利用高压气体击中包覆DNA的金粒子进入细胞.

寡核苷酸

合成的寡核苷酸的用途是灭活疾病过程有关的基因。其中有几种方法达到这一目的。将目的基因antisense达到破坏基因转录的目的。另一种小分子RNA称siRNA,利用它来标记细胞,在mRNAh缺陷基因转录中分开特定的序列,从而打断缺陷mRNA的表达,即基因的表达。还有一种更优方法,使用双链寡核苷酸作为转录因子激活靶基因的转录。转录因子结合,而不是有缺陷的基因,从而降低了目的基因的转录,降低表达。此外,单链寡核苷酸DNA已被用来指导一个突变基因的单碱基改变。寡核苷酸介导的基因修复,有针对性的基因修复,或有针对性的核苷酸改变成为热点。

Lipoplexes and polyplexes

为了提高新的DNA进入细胞内,DNA必须得到保护,免受损害,其进入细胞必须提供便利。为此新的分子lipoplexes和polyplexes,已经成功创建,有能力保护降解过程中的DNA转染。质体DNA可包被脂质,形态有胶束或脂质体。当结构物质复合DNA的成为lipoplex。有三种类型的脂质,阴离子(负电荷),中性,或阳离子(带正电)。起初,阴离子和中性脂质被用于建立lipoplexes来合成载体。然而,在事实的,很少有与他们相关的毒性,它们与体液兼容,但根据组织特异性可适应也有可能,阳离子脂质,由于其正电荷,首次使用带负电荷的DNA分子凝聚,以促进脂质体DNA导入的封装。后来人们发现,利用阳离子脂质显著提高了lipoplexes稳定。另外由于他们负责的结果,阳离子脂质体与细胞膜相互作用,内吞作用被广泛认为是主要路线,使细胞吸收lipoplexes。内涵体的形成,作为内吞作用的结果,但是,如果破坏细胞质内体膜释放基因仍不能成功,它们将被溶酶体消化。有人还发现,虽然可以浓缩阳离子脂质和脂质体封装到的DNA,但由于能力在“内体逃离”方面的不足,转染效率非常低。然而,当助手脂类(通常电中性脂肪,如涂料,)分别加入,形成lipoplexes,可以观察到更高的转染效率。后来,有人想出了某些脂类有能力颠覆内体膜,以便DNA逃脱从内体,因此那些被称为脂质膜融合脂质。虽然阳离子脂质体载体已被广泛用作传递一种替代基因,阳离子脂质剂量依赖性毒性也可能会限制他们的治疗用途。lipoplexes的使用最普遍的基因已经被转移到癌细胞,其中所提供的基因在细胞中激活肿瘤抑制基因的控制,降低致癌基因的活性。最近的研究表明lipoplexes可用于治疗遗传性疾病如囊性纤维化呼吸。DNA复合物与聚合物被称为polyplexes。

混合方法

由于每一个基因转移方法都是有缺陷的,开发有两个或两个以上相结合的混合方法的一些技术会更有效。 Virosomesare是一个例子;他们结合脂质体灭活艾滋病病毒或流感病毒。这已被证明具有更有效的转移方法,位于呼吸道上皮细胞相比于比任何单独的病毒或脂质体。其他方法包括与orhybridising病毒混合阳离子脂质与其他病毒载体。

参见